前述研究?jī)?yōu)化了使用6孔板、6孔板3D固定床模型和CEL-G® Culture Ad60固定床反應(yīng)器（Ad60 FBR）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染含綠色熒光蛋白copGFP的LVs包裝質(zhì)粒TT-CP1的工藝策略，并確認(rèn)了TT-CP1質(zhì)粒在AD60 FBR中能夠成功產(chǎn)出表達(dá)。
前述研究文章：案例應(yīng)用丨慢病毒生產(chǎn)界的“光速引擎”！CEL-G® Culture Ad60 固定床反應(yīng)器讓轉(zhuǎn)染效率飛起來(lái)！
本文接下來(lái)將介紹AD60 FBR在慢病毒生產(chǎn)過(guò)程又一典型的應(yīng)用案例，該研究對(duì)慢病毒生產(chǎn)過(guò)程中質(zhì)粒轉(zhuǎn)染條件和細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)進(jìn)行了工藝測(cè)試及優(yōu)化，并使用優(yōu)化后的工藝條件在表面積為2m2的AD60 FBR驗(yàn)證測(cè)試收獲了高達(dá)2.4×1010 TU產(chǎn)量的慢病毒。研究結(jié)果為建立基于AD60 FBR的慢病毒載體高效生產(chǎn)工藝提供了強(qiáng)有力的數(shù)據(jù)支撐。
該研究結(jié)果來(lái)自于華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，研究過(guò)程中使用的PET膜材及AD60 FBR系上海同騰生物科技有限公司自主研發(fā)。文末可查看原文，以下為主要研究結(jié)果。
固定床反應(yīng)器制備
慢病毒載體的需求及應(yīng)用
基因治療能將外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞中，通過(guò)抑制或增強(qiáng)基因表達(dá)、修正靶基因，從而實(shí)現(xiàn)疾病的治療。而在諸多外源基因的轉(zhuǎn)移方法中，慢病毒載體具有巨大的應(yīng)用潛力。慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科中的復(fù)雜逆轉(zhuǎn)錄病毒，大多由人類免疫缺陷病毒-1 (Human Immunodeficiency Virus Type 1, HIV-1) 改造而來(lái)，能夠同時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂及非分裂期細(xì)胞，具有將外源基因穩(wěn)定整合至宿主細(xì)胞基因組的能力。目前慢病毒載體的應(yīng)用市場(chǎng)廣闊且前景可觀，預(yù)計(jì)2026年慢病毒市場(chǎng)將增長(zhǎng)至8億美元。
慢病毒的生產(chǎn)主要使用貼壁生長(zhǎng)的HEK293T細(xì)胞，為實(shí)現(xiàn)慢病毒的生產(chǎn)，需要對(duì)HEK293T細(xì)胞進(jìn)行規(guī)模化培養(yǎng)。目前較多使用的細(xì)胞工廠制備工藝路線生產(chǎn)LVs具有多重限制，其中包括且不限于收獲時(shí)間限定較緊、人工勞動(dòng)強(qiáng)度大、系統(tǒng)操作多為開(kāi)放式并且需要大量的培養(yǎng)箱空間，這些限制為后續(xù)商業(yè)化規(guī)模的病毒制備帶來(lái)了壓力，為了克服當(dāng)前工藝的局限性，固定床生物反應(yīng)器這種擴(kuò)展性高的三維貼壁培養(yǎng)體系正在逐漸應(yīng)用流行，其中商業(yè)化較為成熟的固定床反應(yīng)器包括 Pall 公司的iCELLis 和 Univercells 公司的 Scale-X 以及國(guó)產(chǎn)品牌上海同騰生物的AD60 FBR。
AD60 FBR反應(yīng)罐體內(nèi)填充有固定化細(xì)胞的固相載體PET膜材料（Fig.1），可以為細(xì)胞貼附生長(zhǎng)提供適宜的介質(zhì)類型、氣體控制、溫度控制及pH控制等多重精細(xì)化支持。當(dāng)細(xì)胞被攪拌驅(qū)動(dòng)攔截在雙層螺旋纏繞的PET膜材空隙中時(shí)，培養(yǎng)液流經(jīng)后與細(xì)胞進(jìn)行傳質(zhì)傳氧，這種培養(yǎng)方式極大的避免了攪拌引發(fā)的剪切力及碰撞造成的細(xì)胞損傷等。相對(duì)于細(xì)胞工廠而言，固定床反應(yīng)器有著明顯的培養(yǎng)面積優(yōu)勢(shì)，AD60 FBR培養(yǎng)面積設(shè)計(jì)為1 m2/2 m2、20 m2以及60 m2，對(duì)應(yīng)的細(xì)胞工廠層數(shù)（細(xì)胞工廠每層培養(yǎng)表面積0.063m2）分別是16/32層、320層以及950層，放大規(guī)模的AD600 FBR培養(yǎng)面積則高達(dá)300 m2/600 m2，對(duì)應(yīng)的細(xì)胞工廠層數(shù)更是達(dá)到了4800層/9600層。另外細(xì)胞在AD60 FBR培養(yǎng)過(guò)程中的分布十分均勻，能對(duì)后續(xù)批次重復(fù)及放大提供穩(wěn)定性與重復(fù)性支持，從而能加快產(chǎn)品上市速度。
Figure 1 AD60 FBR反應(yīng)器及載體膜材示意圖
慢病毒生產(chǎn)工藝的
測(cè)試及優(yōu)化參數(shù)選擇
在使用固定床反應(yīng)器生產(chǎn)慢病毒的過(guò)程中，轉(zhuǎn)染條件(如轉(zhuǎn)染時(shí)DNA的濃度、轉(zhuǎn)染試劑與DNA的比例)以及細(xì)胞培養(yǎng)操作參數(shù) (如接種密度、轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度等)均能夠影響慢病毒的生產(chǎn)。為了實(shí)現(xiàn)高效的慢病毒生產(chǎn)，需要探究轉(zhuǎn)染條件對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響和操作參數(shù)對(duì)慢病毒滴度的影響，據(jù)此設(shè)計(jì)并開(kāi)發(fā)慢病毒生產(chǎn)工藝。
研究結(jié)果
本研究首先考察了轉(zhuǎn)染試劑聚乙烯亞胺 (Polyethyleneimine, PEI)與DNA 的混合比例、混合時(shí)的 DNA濃度和混合時(shí)間、轉(zhuǎn)染時(shí)DNA的濃度和轉(zhuǎn)染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)染效率及外源基因表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染條件分別設(shè)置為：PEI與DNA的質(zhì)量比為0.5:1, 1:1, 2:1, 4:1,6:1，PEI與DNA混合時(shí)轉(zhuǎn)染復(fù)合物中DNA的濃度為5, 10, 20, 40, 60μg/mL，混合時(shí)間為 0, 5, 10, 20, 30, 60 min，轉(zhuǎn)染時(shí)的DNA濃度為1, 2, 3, 4 μ g/mL，轉(zhuǎn)染持續(xù)時(shí)間為2, 4, 6, 8, 10, 12 h。
當(dāng)PEI與DNA質(zhì)量比為 2:1，轉(zhuǎn)染時(shí)DNA濃度為2 μ g/mL，轉(zhuǎn)染時(shí)間為6 h時(shí)，轉(zhuǎn)染效率即可達(dá)到最高，繼續(xù)增加此3個(gè)轉(zhuǎn)染條件的設(shè)置值，轉(zhuǎn)染效率不再提高（Fig.2，a、d、e）。而轉(zhuǎn)染復(fù)合物中 DNA 濃度和混合時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)染效率無(wú)顯著影響（Fig.2，b、c）。
Figure 2 轉(zhuǎn)染條件對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響：(a) PEI:DNA；(b) 轉(zhuǎn)染復(fù)合物中DNA濃度；(c) 混合時(shí)間；(d) 轉(zhuǎn)染時(shí)DNA濃度；(e) 轉(zhuǎn)染時(shí)間 (**: p<0.01; ***: p<0.001)
當(dāng)PEI與DNA的比例為2:1時(shí)相對(duì)熒光強(qiáng)度最大，隨上述比例繼續(xù)增大，相對(duì)熒光強(qiáng)度出現(xiàn)了小幅下降（Fig.3, a）、轉(zhuǎn)染時(shí)的DNA濃度增大和轉(zhuǎn)染時(shí)間延長(zhǎng)均有利于外源基因表達(dá)（Fig.3, d、e），但較高的DNA濃度將增加生產(chǎn)成本，且在無(wú)血清培養(yǎng)條件下長(zhǎng)時(shí)間轉(zhuǎn)染可能導(dǎo)致細(xì)胞活性降低。因此選擇2μg/mL的DNA濃度和6 h 的轉(zhuǎn)染時(shí)間。轉(zhuǎn)染復(fù)合物中DNA濃度和混合時(shí)間對(duì)基因表達(dá)量的影響較小，二者分別為 20μg/mL 和10 min時(shí)基因表達(dá)量最高（Fig.3, b、c）。
Figure 3 轉(zhuǎn)染條件對(duì)基因表達(dá)的影響：(a) PEI:DNA；(b) 轉(zhuǎn)染復(fù)合物中DNA濃度；(c) 混合時(shí)間；(d) 轉(zhuǎn)染時(shí)DNA濃度；(e) 轉(zhuǎn)染時(shí)間 (*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001)
基于優(yōu)化后的轉(zhuǎn)染條件，在孔板和載有PET膜材的孔板（即孔板3D固定床模型）中進(jìn)行慢病毒生產(chǎn)。在孔板中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，生產(chǎn)的慢病毒滴度較高，可達(dá)2.9×107 TU/mL，表明在優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件下可以生產(chǎn)高滴度的慢病毒。與孔板組相比，孔板3D固定床模型組的慢病毒滴度較低（Fig.4）。考慮到PET膜材具有較高的比表面積，與孔板相比可以支持更多的細(xì)胞貼附和生長(zhǎng)，因此需優(yōu)化轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度等參數(shù)，以提高收獲的慢病毒滴度。
Figure 4 孔板及孔板3D固定床模型生產(chǎn)的慢病毒滴度
隨后將PET膜材置于搖瓶中，采用動(dòng)態(tài)培養(yǎng)模型模擬固定床反應(yīng)器中的培養(yǎng)過(guò)程（即搖瓶3D固定床模型），探究接種密度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。將 HEK293T 細(xì)胞按 2.0×103, 5.0×103, 1.0×104, 5.0×104cells/cm2的密度分別接種至搖瓶中并進(jìn)行培養(yǎng)。在5.0×104cells/cm2的接種密度下，搖瓶中HEK293T細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞在第6天進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，第12天時(shí)細(xì)胞密度最高，達(dá)到2.8×106cells/cm2。此后細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期（Fig.5）。
Figure 5 不同接種密度下的HEK293T細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
對(duì)不同接種密度下第6, 10和14天的細(xì)胞進(jìn)行活死染色，活細(xì)胞被染成綠色，死細(xì)胞被染成紅色。在較高的接種密度 (1.0×104和5.0×104cells/cm2)下，HEK293T細(xì)胞在搖瓶3D固定床模型上的分布較為均勻。培養(yǎng)至第10天時(shí)，5.0×104cells/cm2組的細(xì)胞已長(zhǎng)滿整個(gè)膜材，活性良好。而接種密度降低，膜材上的細(xì)胞呈團(tuán)簇聚集，不均勻的細(xì)胞分布和過(guò)低的細(xì)胞密度不利于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和病毒生產(chǎn)。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)將采用5.0×104cells/cm2的接種密度（Fig.6）。
Figure 6 不同接種密度下的HEK293T細(xì)胞活性和分布
隨后在搖瓶3D固定床模型細(xì)胞密度分別為2.0×105,5.0×105,1.0×106, 2.0×106 cells/cm2時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，考察轉(zhuǎn)染密度對(duì)慢病毒生產(chǎn)的影響。轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度為 2.0×105和5.0×105cells/cm2時(shí)，單細(xì)胞產(chǎn)毒量相近，約為0.5 TU/cell。當(dāng)細(xì)胞密度升至 1.0×106cells/cm2時(shí)，單細(xì)胞產(chǎn)毒量提高至0.8 TU/cell；與其他各組相比，單位體積、單位載體面積、單位細(xì)胞的病毒產(chǎn)量均最高。當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步提升時(shí)，單細(xì)胞產(chǎn)毒量反而下降（Fig.7）。
Figure 7 轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度對(duì)慢病毒滴度的影響：(a) TU/mL；(b) TU/cm2 ；(c) TU/cell (與“10”對(duì)比; ***: p<0.001)
最后在AD60 FBR中應(yīng)用優(yōu)化后的轉(zhuǎn)染條件和細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)進(jìn)行慢病毒制備，在反應(yīng)器中以5.0×104 cells/cm2的密度接種細(xì)胞，培養(yǎng)期間每天取樣，檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)；當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1.0×106 cells/cm2時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后更換含血清培養(yǎng)基。慢病毒生產(chǎn)期間每天檢測(cè)培養(yǎng)上清液中葡萄糖濃度。分析AD60 FBR中HEK293T細(xì)胞的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)（Fig.8），培養(yǎng)第1天時(shí)細(xì)胞密度為5.7×104 cells/cm2，大于接種密度，表明細(xì)胞貼附后開(kāi)始擴(kuò)增。在第3天細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，第5天細(xì)胞密度增加至1.0×106 cells/cm2。與搖瓶的培養(yǎng)結(jié)果相比，固定床反應(yīng)器中細(xì)胞更快進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期。
Figure 8 固定床反應(yīng)器中的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
對(duì)AD60 FBR中生長(zhǎng)階段的細(xì)胞活性和分布情況進(jìn)行了檢測(cè)（Fig.9）。由圖可知，反應(yīng)器載體填充材料PET膜材是由無(wú)序堆積的纖維形成的三維細(xì)胞培養(yǎng)載體；除部分纖維較稀疏的區(qū)域，細(xì)胞經(jīng)過(guò)5天生長(zhǎng)后可較均勻地鋪滿材料，細(xì)胞活性良好，未見(jiàn)可觀察到的死細(xì)胞。表明該接種密度和轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度較為合適，在充分利用PET床面積的同時(shí)未導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度重疊、聚團(tuán)。
Figure 9 固定床反應(yīng)器中的細(xì)胞分布
對(duì)AD60 FBR反應(yīng)器中生產(chǎn)出的慢病毒進(jìn)行了滴度檢測(cè)，在質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染后的第3天(即培養(yǎng)第8天)，慢病毒滴度顯著增加，此時(shí)上清液中的病毒滴度可達(dá)1.3×107 TU/mL、8.5×106 TU/cm2，單細(xì)胞產(chǎn)毒量為 8.5 TU/cell；與之相比，培養(yǎng)第 7 天時(shí)，上清液中病毒滴度為 2.5×106 TU/mL、1.7×106 TU/cm2，單細(xì)胞產(chǎn)毒量為1.7 TU/cell。培養(yǎng)第7天收獲1 L培養(yǎng)上清液，培養(yǎng)第8天收獲1.7 L培養(yǎng)上清液，合計(jì)收獲總病毒量為2.4×1010 TU，平均病毒滴度為8.9×106 TU/mL、9.6×106 TU/cm2 (以2 m2等效面積計(jì)算為 1.2×106TU/cm2)和9.6 TU/cell。上述數(shù)據(jù)證實(shí)AD60 FBR生產(chǎn)出的慢病毒滴度較高，表明所優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件和生產(chǎn)條件支持固定床反應(yīng)器中慢病毒的高效生產(chǎn)。
Figure 10 固定床反應(yīng)器中生產(chǎn)的慢病毒滴度：(a) TU/mL；(b) TU/cm2 ；(c) TU/cell
以CEL-G® Culture Ad60為代表的固定床生物反應(yīng)器作為細(xì)胞大規(guī)模貼壁培養(yǎng)的設(shè)備，在慢病毒制備領(lǐng)域證實(shí)具有巨大的潛力。華東理工大學(xué)的研究通過(guò)優(yōu)化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染條件和細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了固定床反應(yīng)器中的高滴度慢病毒生產(chǎn)。相信未來(lái)通過(guò)工藝進(jìn)一步優(yōu)化，AD60 FBR可以為L(zhǎng)Vs乃至更多病毒載體的大規(guī)模制備提供解決方案。并且，隨著研究的不斷深入，以固定床反應(yīng)器為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)可擴(kuò)展、經(jīng)濟(jì)高效且臨床可接受的病毒生產(chǎn)工藝將會(huì)成為實(shí)現(xiàn)基因和細(xì)胞療法變革的基石。
